Nichtlineare konfokale Mikroskopie und Photomanipulation mit neuartigen Femtosekunden-Lichtquellen

Die nichtlineare konfokale Mikroskopie stellt ein neues und interessantes Werkzeug zur Untersuchung biologischer Prozesse in lebenden Zellen und Organismen dar. Die Multiphotonen-Anregung bietet dabei den Vorteil, dass sie nur auf das Fokusvolumen beschränkt ist. In der Mikroskopie ermöglicht dies eine hohe Ortsauflösung, besonders in axialer Richtung. Da Wellenlängen um 1 µm einen guten Kompromiss zwischen Absorption und Streuung darstellen, ist es mit der Multiphotonen-Mikroskopie möglich, tief in streuendes Gewebe vorzudringen. Aufgrund ihrer einfachen Handhabung und ihrer Vielseitigkeit sind Faserlaser eine interessante Alternative zu Ti:Saphir-Lasern für die Multiphotonen-Mikroskopie [1].

Abbildung 1: Schematische Skizze des Laser-Systems
Abbildung 2: Zellkern einer HeLa229 Zelle nach Schadensinduktion bei 1050 nm. In Rot (Hoechst 33342) dargestellt ist das Chromatin, in Grün die Akkumulation des DNA-Reparaturproteins XRCC1 (XRCC1-GFP). Die Einschränkung der DNA-Schädigung in allen drei Raumdimensionen auf ein Volumen innerhalb des Zellkerns ist deutlich zu sehen.

Die Multiphotonen-Anregung kann auch dazu genutzt werden, gezielt Manipulationen in lebenden Zellen vorzunehmen. So lassen sich zum Beispiel über Drei-Photonen-Absorption Schäden in DNA induzieren. Dies erlaubt es zu beobachten, wie DNA Reparaturproteine an diese Schädigungen rekrutiert werden [2]. Ein genauere Untersuchung der unterschiedlichen Schadensarten, die durch Femtosekunden-Laserstrahlung induziert werden, hat ergeben, dass es bei einer Wellenlänge von 1050 nm möglich ist, spezifisch DNA-Strangbrüche zu induzieren, während bei einer Wellenlänge von 775 nm zusätzlich auch noch andere Arten von DNA-Läsionen entstehen (UV-Photoprodukte) [3].

Neben fluoreszierenden Proteinen zur Untersuchung von dynamischen Prozessen in Zellen können auch photoaktivierbare Proteine als Marker verwendet werden. Diese Proteine fluoreszieren nicht, können aber durch Lichtpulse bestimmter Wellenlänge so modifiziert werden, dass sie danach zur Fluoreszenz angeregt werden können. Diese Eigenschaft lässt sich optimal dazu nutzen, um die Mobilität von Proteinen zu beobachten. Durch die Kombination einer Multiphotonen-Photoaktivierung mit einer Multiphotonen-DNA-Schädigung ist es möglich, den Einfluss eines DNA-Schadens auf das Bindungsverhalten von Proteinen an DNA zu untersuchen.

Referenzen

[1] D. Träutlein, F. Adler, K. Moutzouris, A. Jeromin, A. Leitenstorfer und E. Ferrando-May
"Highly versatile confocal microscopy system based on a tunable femtosecond Er:fiber source"
J. Biophoton. 1, 53 (2008)

[2] U. Camenisch, D. Träutlein, F. C. Clement, J. Fei, A. Leitenstorfer, E. Ferrando-May und H. Naegeli
"Two-stage dynamic DNA quality check by xeroderma pigmentosum group C protein"
The EMBO Journal 28, 2387 (2009)

[3] D. Träutlein, M. Deibler, A. Leitenstorfer und E. Ferrando-May
"Specific local induction of DNA strand breaks by infrared multi-photon absorption"
Nucleic Acids Res. 38, e14 (2010)